Viroporinas e Cálcio: Um Papel Crítico na Patogênese Viral
Legenda: A frequência das ICWs está associada à virulência.(A) Projeções de intensidade máxima de monocamadas de células MA104-GCaMP6s após infecção com inóculo de controle (mock), rotavírus OSUv ou OSUa a uma MOI (multiplicidade de infecção) de 0,01. As ICWs são indicadas por regiões de alta intensidade de GCaMP6s (verde) ao redor das células infectadas pelo rotavírus (magenta), observadas predominantemente na monocamada infectada com OSUv. Regiões de cada monocamada, medindo 10 mm por 10 mm, foram imageadas por 30 minutos, começando 18 horas após a infecção (hpi).
(B) Monocamadas de MA104-GCaMP6s foram infectadas a uma MOI de 0,005 e imageadas entre 8 e 24 hpi. As ICWs foram quantificadas utilizando um pipeline automatizado desenvolvido no software FIJI. A quantidade relativa foi normalizada em relação à média do número de ICWs nas monocamadas de controle em cada réplica biológica (à esquerda) e o tempo de latência das ICWs foi comparado entre as infecções por controle, OSUv e OSUa (à direita). Os dados foram combinados de três réplicas biológicas.
(C) Trajetórias representativas de cálcio intracelular (Ca²⁺) em células infectadas com controle, OSUv ou OSUa.
(D) Monocamadas representativas de organoides intestinais humanos (HIO) expressando GCaMP6s (verde) e infectadas com inóculo de controle, rotavírus humano virulento ou uma cepa atenuada de rotavírus. As monocamadas foram imageadas entre 8 e 24 hpi antes de serem fixadas e coradas para antígeno de rotavírus (magenta). As ICWs detectadas ao longo do curso da imagem foram pseudocoloridas arbitrariamente e projetadas em uma única imagem para cada ponto de observação.
(E) Quantidade de ICWs (a), número de células infectadas (**b**) e porcentagem da área da monocamada positiva para o antígeno de rotavírus comparadas entre infecções por controle, cepa Ito (virulenta) e RV1 (atenuada) (**c**). Os dados foram combinados de três réplicas biológicas. Os gráficos de barras representam a média, com barras de erro indicando o desvio padrão (SD). *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 e ****P < 0,0001. Outliers foram removidos pelo método ROUT (Q = 1%) e a normalidade foi determinada pelos testes Shapiro-Wilk. As análises de (B) (à esquerda) e (E) (**a**) foram realizadas com o teste de Kruskal-Wallis seguido pelo teste de comparações múltiplas de Dunn. As análises de (B) (à direita) e (E) (b e c) foram realizadas com o teste de Mann-Whitney. FOV, campo de visão; ns, não significativo.
Creditos da imagem: Gebert et al, 2025
Este estudo explora como as viroporinas, proteínas virais que formam canais iônicos, desempenham um papel central na patogênese viral ao manipular os sinais de cálcio intracelulares e intercelulares. Utilizando o rotavírus como modelo, os pesquisadores analisaram o impacto da proteína NSP4, uma viroporina que facilita a liberação de cálcio do retículo endoplasmático (RE). Essa atividade desencadeia ondas de cálcio intercelulares (ICWs), que contribuem para a formação de nichos de replicação viral, amplificação da disseminação e exacerbação da doença.
Principais Descobertas:
Função Crítica da NSP4 na Patogênese:
A proteína NSP4 demonstrou ser suficiente para induzir ICWs em células infectadas. Essa atividade depende de sua capacidade como viroporina de mobilizar cálcio intracelular. Experimentos com mutantes de NSP4 incapazes de formar canais de cálcio confirmaram que a viroporina é essencial para a ocorrência de ICWs, sem a qual houve redução na replicação viral e atenuação da doença.
Impacto na Resposta Imunológica Inata:
A sinalização de cálcio mediada pela NSP4 desencadeia mudanças transcricionais no hospedeiro, ativando genes regulados por fatores de transcrição como NF-κB. Essas alterações estão associadas a respostas imunológicas inatas, incluindo a expressão de citocinas pró-inflamatórias como IL-6 e CXCL8, porém não foram suficientes para conter o progresso da infecção.
Efeitos na Patogenicidade em Modelos Animais e Organoides:
Modelos de organoides intestinais humanos e murinos mostraram que a NSP4 do rotavírus virulento (OSUv) induziu mais ICWs e maior secreção de fluidos, um marcador da patogênese intestinal. Em camundongos neonatais, a infecção com vírus contendo NSP4 de alta atividade resultou em maior eliminação viral e um menor número de partículas virais necessárias para induzir diarreia, confirmando o papel da NSP4 na gravidade da doença.
Conservação Funcional da NSP4 entre Espécies:
A capacidade de gerar ICWs foi identificada em NSP4 de rotavírus de diferentes origens, incluindo humanos, suínos e símios, indicando que essa função é uma característica conservada entre os rotavírus do grupo A.
Implicações Terapêuticas:
Os resultados sugerem que a viroporina NSP4 pode ser um alvo terapêutico promissor. Inibir sua função ou bloquear os processos de sinalização de cálcio, como ICWs, pode reduzir a replicação viral e a gravidade da doença. Além disso, modificar a NSP4 em vacinas atenuadas pode permitir a criação de cepas seguras e imunogênicas, sem prejudicar a resposta imune do hospedeiro.
Relevância Ampliada:
A manipulação de cálcio intracelular por viroporinas não é exclusiva do rotavírus. Outros patógenos, como coronavírus e toxinas bacterianas, utilizam mecanismos similares para promover infecção e patogênese. Este trabalho estabelece uma base para estudos futuros sobre viroporinas e destaca a importância de explorar esses mecanismos em outros contextos virais.
O estudo amplia o entendimento sobre os mecanismos moleculares do rotavírus e sugere novas abordagens para tratar doenças causadas por patógenos que exploram o cálcio como mediador biológico.